एमपीएक्सवी पीसीआर वानरपोक्स वायरस फ्रीज-ड्राई मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन

ऑपरेशन प्रक्रिया

1) न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण उचित निष्कर्षण किट का उपयोग करके नमूनों से डीएनए निकालें। यह अनुशंसा की जाती है कि निष्कर्षण के अंतिम चरण में न्यूक्लिक एसिड को लगभग 100 μl एल्यूशन बफर (TE या न्यूक्लिएज-मुक्त H2O) के साथ निकाला जाए। शुद्ध न्यूक्लिक एसिड का तुरंत उपयोग किया जाना चाहिए या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

2) पॉजिटिव कंट्रोल तैयारी पॉजिटिव कंट्रोल को पुनर्जलीकरण से पहले परिवेश के तापमान पर 12 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। इसका उपयोग करने से पहले 250 μl TE बफर या न्यूक्लिएज-मुक्त H2O मिलाकर, कम गति पर 15-20 सेकंड तक घुमाकर, और कम गति पर 15-20 सेकंड तक सेंट्रीफ्यूज करके पुनर्जलीकरण किया जाना चाहिए। तुरंत उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3) रियल-टाइम आरटी-पीसीआर मिक्स तैयारी

ए) वैक्यूम पैकेज खोलें और अभिकर्मक युक्त 8-ट्यूब स्ट्रिप्स निकालें। जांचें कि गोली ट्यूब के तल पर है (आवश्यकतानुसार ट्यूबों की संख्या काटें)। यदि प्रदान की गई ट्यूब आपके उपकरण के साथ संगत नहीं हैं, तो अभिकर्मक गोली को आपके उपकरण के साथ संगत एक ऑप्टिकल ट्यूब में स्थानांतरित करें।

बी) ट्यूब खोलें और टोपी(ओं) को त्याग दें (रियल-टाइम पीसीआर मशीनों के लिए उपयुक्त नहीं), और नीचे के रूप में बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें

* न्यूक्लिएज-मुक्त पानी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।

सी) ट्यूबों को ऑप्टिकल कैप या 96-वेल प्लेट को ऑप्टिकल सील फिल्म (प्रदान नहीं किया गया) से सील करें।

डी) ट्यूबों को कम गति पर 10~15 सेकंड के लिए घुमाएँ, और 3000rpm पर 20 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और उन्हें रियल-टाइम पीसीआर उपकरण में रखें।

3) आरटी-पीसीआर सेटअप: प्रतिक्रिया की मात्रा 25μl के रूप में सेट करें, और पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया नीचे दी गई है। 60 डिग्री सेल्सियस पर FAM (N जीन के लिए), HEX (E जीन के लिए), ROX (Orf1ab के लिए) और CY5 (RNase P जीन के लिए) प्रतिदीप्ति एकत्र करें, और निष्क्रिय संदर्भ के रूप में NONE का चयन करें।
4) परिणाम विश्लेषण और व्याख्या उपकरण के निर्देशों के अनुसार थ्रेसहोल्ड लाइन सेट करें।

ए) गुणवत्ता नियंत्रण:

बी) नमूना परिणाम व्याख्या

तकनीकी पैमाने: