एंटी थायराइड पेरोक्साइडस एलिसा टेस्ट किट एंटी टीपीओ एंटीबॉडी टेस्ट किट

एंटी-टीपीओ एंटी-थायराइड पेरोक्साइडस एलिसा किट

1. इच्छित उपयोग

मानव सीरम में थायरॉयड पेरोक्सीडेज के एंटीबॉडी के इन विट्रो मात्रात्मक निर्धारण के लिए इम्यूनोसे।एंटी-टीपीओ निर्धारण का उपयोग ऑटोइम्यून थायरॉयड रोगों के निदान में सहायता के रूप में किया जाता है।

2. सारांश 

• थायरॉइड-विशिष्ट पेरोक्सीडेज (टीपीओ) थायरोसाइट्स के माइक्रोसोम्स पर मौजूद होता है और इसकी एपिकल सेल सतह पर व्यक्त किया जाता है।थायरोग्लोबुलिन (टीजी) के साथ तालमेल में इस एंजाइम का एल-टायरोसिन के आयोडिनेशन में एक आवश्यक कार्य है और परिणामी मोनो‐ और डाय-आयोडोटायरोसिन के रासायनिक युग्मन से थायरॉइड हार्मोन टी 4, टी 3 और एफटी 3 बनते हैं।
• टीपीओ एक संभावित स्वप्रतिजन है।टीपीओ के प्रति एंटीबॉडी के ऊंचे सीरम टाइटर्स पाए जाते हैं ऑटोइम्यूनिटी के कारण थायरॉयडिटिस के कई रूप।अभी भी अक्सर पाया जाने वाला शब्द "माइक्रोसोमल एंटीबॉडी" उस समय से उत्पन्न होता है जब टीपीओ को अभी तक माइक्रोसोम के कारण होने वाले ऑटोइम्यूनिटी में एंटीजन के रूप में पहचाना नहीं गया था।नैदानिक ​​​​अर्थ में दो शब्द एंटी-टीपीओ और माइक्रोसोमल एंटीबॉडी को समानार्थक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है;हालांकि, परीक्षण विधियों के संबंध में मतभेद हैं।
• उच्च एंटी-टीपीओ टाइटर्स 90% रोगियों में क्रोनिक हाशिमोटो के थायरॉयडिटिस के साथ पाए जाते हैं।ग्रेव्स रोग में, 70% रोगियों में एक ऊंचा अनुमापांक होता है।यद्यपि प्रक्रिया की संवेदनशीलता को एक साथ अन्य थायरॉयड एंटीबॉडी (एंटी-टीजी, टीएसएच-रिसेप्टर-एंटीबॉडी - टीआरएबी) का निर्धारण करके बढ़ाया जा सकता है, एक नकारात्मक खोज एक ऑटोइम्यून बीमारी की संभावना से इंकार नहीं करती है।एंटीबॉडी टिटर का परिमाण रोग की नैदानिक ​​गतिविधि से संबंधित नहीं है।बीमारी की लंबी अवधि के बाद या छूट के दौरान शुरू में ऊंचा टाइटर्स नकारात्मक हो सकता है।यदि एंटीबॉडी छूट के बाद फिर से प्रकट होते हैं, तो एक विश्राम संभावित है।
• जबकि सामान्य माइक्रोसोमल एंटीबॉडी परीक्षण एक एंटीजन तैयारी के रूप में अशुद्ध माइक्रोसोम को नियोजित करते हैं, एंटी-टीपीओ परीक्षण एक शुद्ध पेरोक्सीडेज का उपयोग करते हैं।नैदानिक ​​संवेदनशीलता के मामले में दो प्रक्रियाएं तुलनीय प्रदर्शन की हैं, लेकिन उपयोग किए गए एंटीजन की उच्च गुणवत्ता के कारण बेहतर लॉट-टू-लॉट स्थिरता और उच्च नैदानिक ​​​​विशिष्टता की उम्मीद एंटी-टीपीओ परीक्षणों से की जा सकती है।एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख मानव प्रतिजन का उपयोग करते हैं और खरगोश मानव विरोधी आईजीजी एंटीबॉडी (एंटी-आईजीजी)।

3. परीक्षण सिद्धांत

अप्रत्यक्ष विधि, परख की कुल अवधि: 70 मिनट।

एंटी-टीपीओ एलिसा दो-चरण ऊष्मायन प्रक्रिया में टीपीओ के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए ठोस चरण, अप्रत्यक्ष एलिसा विधि को नियोजित करता है।पॉलीस्टाइरीन माइक्रोवेल स्ट्रिप्स अत्यधिक प्रतिरक्षी मानव टीपीओ एंटीजन के साथ पूर्व-लेपित हैं।पहले ऊष्मायन चरण के दौरान, एंटी-टीपीओ विशिष्ट एंटीबॉडी, यदि मौजूद हैं, तो ठोस चरण पूर्व-लेपित टीपीओ एंटीजन के लिए बाध्य होंगे।अनबाउंड सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए कुओं को धोया जाता है, और खरगोश विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी (एंटी-आईजीजी) को एंजाइम हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी-कॉन्जुगेट) से जोड़ा जाता है।दूसरे ऊष्मायन चरण के दौरान, ये एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी पहले से बने किसी भी एंटीजन-एंटीबॉडी (आईजीजी) परिसरों के लिए बाध्य होंगे और अनबाउंड एचआरपी-संयुग्म को धोकर हटा दिया जाएगा।टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन (टीएमबी) और यूरिया पेरोक्साइड युक्त क्रोमोजेन समाधान कुओं में जोड़े जाते हैं और एंटीजन-एंटीबॉडी-एंटी-आईजीजी (एचआरपी) इम्युनोकोम्पलेक्स की उपस्थिति में, रंगहीन क्रोमोजेन को नीले रंग के उत्पाद के लिए बाध्य एचआरपी संयुग्म द्वारा हाइड्रोलाइज किया जाता है।सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया को रोकने के बाद नीला रंग पीला हो जाता है।

रंग की तीव्रता की मात्रा को मापा जा सकता है और यह कुओं में कैप्चर की गई एंटीबॉडी की मात्रा और नमूने में एंटीबॉडी की मात्रा के लिए आनुपातिक है।

4. अभिकर्मक सामग्री प्रदान की गई

• लेपित माइक्रोप्लेट, 8 x 12 स्ट्रिप्स, 96 कुएं।मानव टीपीओ प्रतिजन के साथ पूर्व-लेपित।

• अंशशोधक, 6 शीशियां, 1 एमएल प्रत्येक, उपयोग के लिए तैयार;सांद्रता: 0 (ए), 25 (बी), 50 (सी), 100 (डी), 250 (ई) और 500 (एफ) आईयू / एमएल।

• बीएसए (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन) युक्त Tris-NaCl बफर में एंजाइम संयुग्म, 1 शीशी, 11.0 एमएल एचआरपी (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) लेबल खरगोश मानव-विरोधी आईजीजी एंटीबॉडी (एंटी-आईजीजी)।इसमें 0.1% ProClin300 प्रिजर्वेटिव है।

• सीरम मंदक: 1 शीशी, 11mL।बफर लवण और एक डाई युक्त

• वॉश सॉल्यूशन कॉन्सेंट्रेट, 1 शीशी, 25 मिली (40X कॉन्संट्रेटेड), पीबीएस-ट्वीन वॉश सॉल्यूशन।

• सब्सट्रेट, 1 शीशी, 11ml, उपयोग के लिए तैयार, (tetramethylbenzidine) TMB।

• स्टॉप सॉल्यूशन, 1 शीशी, 6.0 मिली 1 mol/l सल्फ्यूरिक एसिड।

• आईएफयू, 1 प्रति।

• प्लेट का ढक्कन: 2 टुकड़े।

आवश्यक सामग्री (लेकिन प्रदान नहीं की गई)

• 450nm और 620nm तरंग दैर्ध्य शोषक क्षमता के साथ माइक्रोप्लेट रीडर।

• माइक्रोप्लेट वॉशर।

• इनक्यूबेटर।

• प्लेट शेकर।

• माइक्रोपिपेट और मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट 1.5% से बेहतर की सटीकता के साथ 50μl वितरित करते हैं।

• शोषक कागज।

• आसुत जल

5. परीक्षण प्रक्रिया

• केवल आवश्यक कुओं की संख्या का उपयोग करें और प्रत्येक अंशशोधक और नमूने की परख के लिए माइक्रोप्लेट कुओं को प्रारूपित करें।

• प्रत्येक कुएं में 100 µ l अंशशोधक जोड़ें ।

• अंशशोधक-कुओं को छोड़कर प्रत्येक कुएं में 100 µ एल नमूना मंदक (हरा रंग) जोड़ें।

• प्रत्येक नमूना मंदक कुएं में 10 μL नमूना जोड़ें (नोट: कुओं में अभिकर्मक हरे से नीले रंग को बदल देंगे), फिर 30 सेकंड हिलाएं।

• प्लेट को प्लेट के ढक्कन से ढक दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

• सूक्ष्म प्लेट की सामग्री को सफाई या आकांक्षा द्वारा त्यागें।अगर सड़ रहा है, तो प्लेट को अब्सॉर्बेंट पेपर से सुखाकर टैप करें और ब्लॉट करें।

• धो समाधान के 350 µ एल जोड़ें, छानना (नल और धब्बा) या महाप्राण।कुल 5 वॉश के लिए 4 अतिरिक्त बार दोहराएं।धोने के अंत में, प्लेट को उल्टा कर दें और किसी भी अवशिष्ट वॉश सॉल्यूशन को अब्सॉर्बेंट पेपर पर टैप करें।

• एंजाइम संयुग्म के 100 µ एल जोड़ें,

• प्लेट को प्लेट के ढक्कन से ढक दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

• धो समाधान के 350 µ एल जोड़ें, छानना (नल और धब्बा) या महाप्राण।कुल 5 वॉश के लिए 4 अतिरिक्त बार दोहराएं।धोने के अंत में, प्लेट को उल्टा कर दें और किसी भी अवशिष्ट वॉश सॉल्यूशन को अब्सॉर्बेंट पेपर पर टैप करें।

• प्रत्येक कुएं में 100 µ एल सब्सट्रेट जोड़ें।10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया के लिए अंधेरे में परिवेश के तापमान (18-25 ℃) पर कवर और इनक्यूबेट करें।सबस्टेट जोड़ने के बाद प्लेट को हिलाएं नहीं।

• प्रत्येक कुएं में 50 µ l स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ें ।

• कुओं के भीतर तरल मिलाने के लिए 15-20 सेकंड के लिए हिलाएं।यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नीला रंग पूरी तरह से पीले रंग में बदल जाए।

• माइक्रो प्लेट रीडर में प्रत्येक कुएं के अवशोषण को 450 एनएम (620 से 630 एनएम का उपयोग करके संदर्भ तरंग दैर्ध्य के रूप में अच्छी तरह से खामियों को कम करने के लिए) पढ़ें।स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ने के 30 मिनट के भीतर परिणामों को पढ़ा जाना चाहिए।